Phytase

ການ ນຳ ໃຊ້ແລະຫຼັກການຂອງ Phytase

ຂັ້ນຕອນນີ້ແມ່ນໃຊ້ເພື່ອ ກຳ ນົດກິດຈະ ກຳ ຂອງເອນໄຊທີ່ປ່ອຍຟອສເຟດຈາກ phytate. ການອ້າງອິງແມ່ນອີງໃສ່ພູມຕ້ານທານ hydrolysis ຂອງໂຊດຽມ phytate ພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂທີ່ຄວບຄຸມໂດຍການວັດແທກປະລິມານຂອງຟອສເຟດທີ່ປ່ອຍອອກມາ.

Reagents ແລະ Solutions 
[ໝາຍ ເຫດ: ເຄື່ອງເຮັດແກ້ວທຸກຊະນິດຕ້ອງໄດ້ຮັບການລ້າງ, ລ້າງແລະລ້າງໃຫ້ສະອາດເພື່ອຮັບປະກັນບໍ່ມີຟອສເຟດ.]
Acetate Buffer (pH 5.5) ລະລາຍ 1,76 g ຂອງກົດອາຊິດຊິລິກ 100% (C2H4O2), ທາດທາດ sodium acetate trihydrate (C2H3O2Na · 3H2O) ປະມານ 0.147 g, ແລະ 0.147 g ຂອງທາດການຊຽມ chloride dihydrate ໃນນ້ ຳ ປະມານ 900 mL. ໂອນວິທີແກ້ໄຂອອກເປັນທ່ອນປະລິມານທີ່ມີຄວາມຈຸ 1000 ມລ, ເຈືອຈາງລົງໃນປະລິມານດ້ວຍນ້ ຳ, ແລະປະສົມ. pH ຄວນຈະເປັນ 5,50 ± 0.05.
ໂຊລູຊູນໂຊຊຽມລະລາຍ 8,40 g ຂອງໂຊດຽມ phytate decahydrate (C6H6O24P6Na12 · 10H2O) (Sigma Chemical Co) ໃນ 900 mL ຂອງ Acetate Buffer. ປັບ pH ໃຫ້ເປັນ 5,50 ± 0.05 ຢູ່ທີ່ 37.0 °± 0.1 °ໂດຍເພີ່ມ 4 ອາຊິດຊິລິກ. ເຢັນກັບອຸນຫະພູມອາກາດລ້ອມຮອບ. ການໂອນປະລິມານທີ່ມີປະລິມານໃຫ້ກັບລະຄັງປະລິມານທີ່ມີຂະ ໜາດ 1000 ມລ, ໃຫ້ລະລາຍປະລິມານກັບ Acetate Buffer, ແລະປະສົມເຂົ້າກັນ. ການກະກຽມສົດປະຈໍາວັນ.
Nitric Acid Solution (27%) ໃນຂະນະທີ່ປັ່ນປ່ວນ, ຄ່ອຍໆເພີ່ມ 70 ມລຂອງ 65% ກົດໄນໂຕຣເຈນໃສ່ນ້ ຳ 130 ມລ.
Ammonium Heptamolybdate Solution ລະລາຍ 100 g ຂອງທາດ ammonium heptamolybdate tetrahydrate [(NH4) 6Mo7O24 · 4H2O] ໃນນ້ ຳ 900 mL ໃນເຕົາປະລິມານ 1000 mL. ຕື່ມ 10 ມລກຂອງນ້ ຳ ແກ້ອາໂມເນຍ 25%, ເຈືອປົນກັບປະລິມານທີ່ມີນ້ ຳ, ແລະປະສົມ. ວິທີແກ້ໄຂນີ້ແມ່ນ ໝັ້ນ ຄົງເປັນເວລາ 4 ອາທິດເມື່ອເກັບຮັກສາໄວ້ໃນອຸນຫະພູມອາກາດລ້ອມຮອບແລະປ້ອງກັນຈາກແສງ.
Ammonium Vanadate Solution ລະລາຍ 2,35 g ຂອງ ammonium monovanadate (NH4VO3) ໃນນ້ ຳ ອຸ່ນ 400 ມລ. ໃນຂະນະທີ່ປັ່ນປ່ວນ, ຄ່ອຍໆຕື່ມ 20 ມລຂອງ Nitric Acid Solution (27%). ເຢັນກັບອຸນຫະພູມອາກາດລ້ອມຮອບ. ການໂອນປະລິມານທີ່ມີປະລິມານເຂົ້າໄປໃນເຕົາປະລິມານໄຟຟ້າຂະ ໜາດ 1000 ມລ, ໃຫ້ລະລາຍປະລິມານກັບນ້ ຳ, ແລະປະສົມເຂົ້າກັນ. ວິທີແກ້ໄຂນີ້ແມ່ນ ໝັ້ນ ຄົງເປັນເວລາ 4 ອາທິດເມື່ອເກັບຮັກສາໄວ້ໃນອຸນຫະພູມອາກາດລ້ອມຮອບແລະປ້ອງກັນຈາກແສງ.
ສີ / ຢຸດການແກ້ໄຂໃນຂະນະທີ່ ກຳ ລັງຂຸ້ນ, ໃຫ້ເພີ່ມ Ammonium Vanadate Solution 250 ມລໃນ 250 ມລຂອງ Ammonium Heptamolybdate Solution. ຄ່ອຍໆເພີ່ມຂະ ໜາດ 165 ມລຂອງ 65% ກົດກົດນິກ. ເຢັນກັບອຸນຫະພູມອາກາດລ້ອມຮອບ. ການໂອນປະລິມານທີ່ມີປະລິມານເຂົ້າໄປໃນເຕົາປະລິມານໄຟຟ້າຂະ ໜາດ 1000 ມລ, ໃຫ້ລະລາຍປະລິມານກັບນ້ ຳ, ແລະປະສົມເຂົ້າກັນ. ການກະກຽມສົດປະຈໍາວັນ.
ການແກ້ໄຂບັນຫາຟົດສະຟໍຣີນໂພແທດຊຽມໂພແທດນຽມແຫ້ງໃນປະລິມານທີ່ພຽງພໍຂອງໂພແທດຊຽມ dihydrogen (KH2PO4) ໃນເຕົາອົບສູນຍາກາດຢູ່ທີ່ 100 °ເຖິງ 104 ° ສຳ ລັບ 2 h. ເຢັນກັບອຸນຫະພູມອາກາດລ້ອມຮອບໃນ desiccator ໃນໄລຍະ gel silica ແຫ້ງ.
ໃນຊ້ ຳ ກັນ (ວິທີແກ້ໄຂ A ແລະ B), ມີນ້ ຳ ໜັກ ປະມານ 0.245 g ຂອງຟອສເຟດ dihydrogen ໂພແທດຊຽມແຫ້ງໃຫ້ຖືກຕ້ອງພາຍໃນ 1 ມລກແລະເຈືອຈາງດ້ວຍ Acetate Buffer ເຖິງ 1 ລິດເພື່ອໃຫ້ໄດ້ວິທີແກ້ໄຂບັນຈຸມີຟອສເຟດໂພແທດຊຽມ dihydrogen 1,80 mm.
ການກະກຽມການອ້າງອີງ Phytase (ການກະກຽມ phytase ທີ່ມີຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນສູງ) ການກະກຽມນີ້ສາມາດໄດ້ຮັບຈາກ Gist-Brocades, Delft, ປະເທດເນເທີແລນ, ໂດຍມີກິດຈະ ກຳ ທີ່ຖືກມອບ ໝາຍ (ໂດຍການຮ່ວມມືກັນ), ຫຼືກິດຈະ ກຳ ຂອງການກະກຽມການອ້າງອີງສາມາດຖືກ ກຳ ນົດຕາມຂັ້ນຕອນ 2.
ວິທີແກ້ໄຂເອກະສານອ້າງອີງ Phytase, ຂັ້ນຕອນທີ 1 ຊັ່ງນ້ ຳ ໜັກ ຂອງ ຈຳ ນວນປະລິມານຂອງການກະກຽມເອກະສານ Phytase ທີ່ສອດຄ້ອງກັນກັບ 20.000 ຫົວ ໜ່ວຍ phytase ຢ່າງຖືກຕ້ອງເຖິງພາຍໃນ 1 ມລກໃນຊ້ ຳ ໃນ flasks vol-200 mL ລະລາຍໃນແລະເຈືອຈາງໃຫ້ກັບປະລິມານທີ່ມີ Acetate Buffer, ແລະປະສົມເຂົ້າກັນ. ເຈືອຈາງດ້ວຍ Acetate Buffer ເພື່ອໃຫ້ມີສານລະລາຍທີ່ບັນຈຸປະມານ 0.01, 0.02, 0.04, 0.06, ແລະ 0.08 ໜ່ວຍ phytase ຕໍ່ 2.0 ມລຂອງລິດສຸດທ້າຍ.
ການກະກຽມຕົວຢ່າງ, ຂັ້ນຕອນທີ 1 ໂຈະຫຼືລະລາຍແລະເຈືອຈາງຂອງນ້ ຳ ໜັກ ຕົວຢ່າງທີ່ຖືກຕ້ອງໃນ Acetate Buffer ເພື່ອໃຫ້ 2.0 ມລຂອງການເຈືອປົນສຸດທ້າຍຈະບັນຈຸລະຫວ່າງ 0,02 ແລະ 0.08 ໜ່ວຍ.

ການກະກຽມຕົວຢ່າງ, ຂັ້ນຕອນທີ່ 2 ໃນຊໍ້າຊ້ອນ, ຊັ່ງນໍ້າ ໜັກ ຂອງ Phytase ກະສານອ້າງອີງການກະກຽມແລະລະລາຍແລະເຈືອຈາງໃນ Acetate Buffer ເພື່ອໃຫ້ໄດ້ສານທີ່ບັນຈຸ 0.06 ± 0.006 ຫົວ ໜ່ວຍ phytase ຕໍ່ 2.0 ມລຂອງການລະລາຍສຸດທ້າຍ.

ຂັ້ນຕອນ
ຂັ້ນຕອນທີ 1 (ການ ກຳ ນົດກິດຈະ ກຳ ຂອງ phytase) ການໂອນຂະ ໜາດ 2.00 ມລຂອງການກະກຽມຕົວຢ່າງ, ຂັ້ນຕອນທີ 1, ແລະຂໍ້ອ້າງອີງ Phytase, ຂັ້ນຕອນທີ 1, ແຍກອອກເປັນທໍ່ທົດສອບແກ້ວຂະ ໜາດ 20- × 150 ມມແຍກຕ່າງຫາກ. ການໃຊ້ໂມງຢຸດແລະການເລີ່ມຕົ້ນໃນເວລາເທົ່າກັບສູນ, ຕາມ ລຳ ດັບຂອງຊຸດແລະພາຍໃນໄລຍະເວລາປົກກະຕິ, ວາງທໍ່ນ້ ຳ ໃສ່ອາບນ້ ຳ 37.0 °± 0.1 °ແລະຊ່ວຍໃຫ້ເນື້ອໃນຂອງມັນສົມດຸນໃນເວລາ 5 ນາທີ. ໃນເວລາເທົ່າກັບ 5 ນາທີ, ຕາມ ລຳ ດັບຂອງຊຸດແລະດ້ວຍໄລຍະເວລາດຽວກັນ, ເພີ່ມ 4.0 ມລຂອງໂຊລູຊັ່ນໂຊລູຊັ່ນ Substrate Solution (ກ່ອນ ໜ້າ ນີ້ເທົ່າກັບ 37.00 ± 0.10) ໃຫ້ແຕ່ລະທໍ່ທົດສອບ. ປະສົມ, ແລະທົດແທນໃນອາບນ້ໍາ 37.0 °± 0.1 °. ໃນເວລາເທົ່າກັບ 65 ນາທີ, ຕາມ ລຳ ດັບດຽວກັນແລະພາຍໃນໄລຍະເວລາດຽວກັນ, ຢຸດການສ້າງບ່ອນໂດຍການເພີ່ມ 4.0 ມລຂອງສີ / Stop Solution. ປະສົມ, ແລະເຢັນກັບອຸນຫະພູມອາກາດລ້ອມຮອບ.
ກະກຽມຊ່ອງຫວ່າງໂດຍການໂອນຂະ ໜາດ 2.00 ມລຂອງຕົວຢ່າງການກະກຽມ, ຂັ້ນຕອນທີ 1, ແລະຂໍ້ອ້າງອີງ Phytase, ຂັ້ນຕອນທີ 1, ແຍກເປັນທໍ່ທົດສອບແກ້ວຂະ ໜາດ 20- × 150 ມມແຍກຕ່າງຫາກ. ການໃຊ້ໂມງຢຸດແລະການເລີ່ມຕົ້ນໃນເວລາເທົ່າກັບສູນ, ຕາມ ລຳ ດັບຂອງຊຸດແລະພາຍໃນຊ່ວງເວລາປົກກະຕິ, ວາງທໍ່ນ້ ຳ ໃສ່ອາບນ້ ຳ 37.0 °± 0.1 °ແລະຊ່ວຍໃຫ້ພວກມັນສາມາດສົມດຸນໄດ້ 5 ນາທີ. ໃນເວລາເທົ່າກັບ 5 ນາທີ, ໃນລໍາດັບຂອງຊຸດແລະພາຍໃນໄລຍະເວລາດຽວກັນ, ຕື່ມ 4.0 ມລຂອງສີ / Stop Solution. ປະສົມ, ແລະເຢັນກັບອຸນຫະພູມອາກາດລ້ອມຮອບ. ຕໍ່ໄປຕື່ມ 4.00 ມລຂອງໂຊລູຊັ່ນ Substrate Solution ໃສ່ທໍ່ເປົ່າ, ແລະປະສົມເຂົ້າກັນ.
ເອົາຫົວຫຼອດທົດສອບທັງ ໝົດ ປະມານ 5 ນາທີໃນລາຄາ 3000 × g. ກຳ ນົດການດູດຊືມຂອງແຕ່ລະວິທີແກ້ໄຂທີ່ 415 nm ໃນຫ້ອງເສັ້ນທາງຍາວ 1 ຊມດ້ວຍກ້ອງສ່ອງທາງໄກທີ່ ເໝາະ ສົມ, ໂດຍໃຊ້ນ້ ຳ ເຮັດໃຫ້ເຄື່ອງມືສູນ.
ຂັ້ນຕອນທີ 2 (ການ ກຳ ນົດກິດຈະ ກຳ ຂອງ phytase ຂອງການກະກຽມການອ້າງອິງ Phytase) ການໂອນ 2.00 ມລຂອງການກະກຽມຕົວຢ່າງ, ຂັ້ນຕອນທີ 2, ແລະ 2.00 ມລ (ສາມເທື່ອຈາກການແກ້ໄຂບັນຫາໂພແທດຊ້ຽມໂພແທດຊຽມໂພແທດຊຽມແລະສອງຄັ້ງຈາກ B) ຂອງໂຊລູຊຽມ Dihydrogen Solutions Phosphate Solutions ເປັນ 20 ແຍກຕ່າງຫາກ - ທໍ່ທົດສອບແກ້ວຂະ ໜາດ 150 ມມ.. ການໃຊ້ໂມງຢຸດແລະການເລີ່ມຕົ້ນໃນເວລາເທົ່າກັບສູນ, ຕາມ ລຳ ດັບຂອງຊຸດແລະພາຍໃນໄລຍະເວລາປົກກະຕິ, ວາງທໍ່ນ້ ຳ ໃສ່ອາບນ້ ຳ 37.0 °± 0.1 °ແລະຊ່ວຍໃຫ້ເນື້ອໃນຂອງມັນສົມດຸນໃນເວລາ 5 ນາທີ. ໃນເວລາເທົ່າກັບ 5 ນາທີ, ຕາມ ລຳ ດັບຂອງຊຸດແລະພາຍໃນໄລຍະເວລາດຽວກັນ, ເພີ່ມຂະ ໜາດ 4.0 ມລຂອງໂຊລູຊັ່ນ Substrate Solution (ກ່ອນ ໜ້າ ນີ້ເທົ່າກັບ 37.0 °± 0.1 °) ໃສ່ທໍ່ທົດລອງ. ປະສົມ, ແລະທົດແທນໃນອາບນ້ໍາ 37.0 °± 0.1 °. ໃນເວລາເທົ່າກັບ 35 ນາທີ, ຕາມ ລຳ ດັບດຽວກັນແລະພາຍໃນໄລຍະເວລາດຽວກັນ, ຢຸດການສ້າງບ່ອນໂດຍການເພີ່ມ 4.0 ມລຂອງສີ / Stop Solution. ປະສົມ, ແລະເຢັນກັບອຸນຫະພູມອາກາດລ້ອມຮອບ.

ກະກຽມຊ່ອງຫວ່າງໂດຍການໂອນຂະ ໜາດ 2.00 ມລຂອງການກະກຽມຕົວຢ່າງ, ຂັ້ນຕອນທີ 2, ເປັນທໍ່ທົດສອບແກ້ວຂະ ໜາດ 20- × 150 ມມແຍກຕ່າງຫາກ. ກະກຽມເຄື່ອງເປົ່າ Reagent Blanks ໂດຍການໂອນນ້ ຳ 2.00 ມລເຂົ້າໄປໃນຊຸດທົດລອງແກ້ວຂະ ໜາດ 20 × 150 ມມ 5 ແຍກ 5 ໜ່ວຍ. ເພີ່ມວິທີແກ້ໄຂສີ / ຢຸດຂະ ໜາດ 4.0 ມລໃສ່ທໍ່ເປົ່າທຸກຢ່າງແລະປະສົມເຂົ້າກັນ. ຕໍ່ໄປຕື່ມ 4.0 ມລຂອງໂຊລູຊັ່ນ Substrate Solution, ແລະປະສົມ. ກຳ ນົດການດູດຊືມຂອງແຕ່ລະວິທີແກ້ໄຂທີ່ 415 nm ໃນຫ້ອງເສັ້ນທາງຍາວ 1 ຊມດ້ວຍກ້ອງສ່ອງທາງໄກທີ່ ເໝາະ ສົມ, ໂດຍໃຊ້ນ້ ຳ ເຮັດໃຫ້ເຄື່ອງມືສູນ.

ການຄິດໄລ່
ການຄິດໄລ່, ຂັ້ນຕອນ 1 ໜ່ວຍ ໜຶ່ງ Phytase (fytase) (FTU) ແມ່ນ ຈຳ ນວນປະລິມານຂອງເອນໄຊທີ່ຊ່ວຍປົດປ່ອຍຟອສເຟດທີ່ມີທາດອົກຊີແຊນໃນອັດຕາ 1 µmol / ນາທີຈາກ sodium phytate 0.0051 mol / L ທີ່ 37.00 ທີ່ pH 5.50 ພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂຂອງການທົດສອບ. ຄິດໄລ່ການດູດຊືມທີ່ຖືກຕ້ອງ (ຕົວຢ່າງລົບເປົ່າ) ສຳ ລັບແຕ່ລະຕົວຢ່າງຂອງການກະກຽມຕົວຢ່າງແລະ Phytase Reference Solution. ວາງແຜນກິດຈະ ກຳ phytase ທີ່ຄິດໄລ່ຢ່າງຖືກຕ້ອງ (FTU ຕໍ່ 2 ມລ) ຂອງແຕ່ລະ Phytase Reference Solution ຕໍ່ກັບການດູດຊຶມທີ່ສອດຄ້ອງກັນ. ຈາກເສັ້ນໂຄ້ງ, ກຳ ນົດການເຄື່ອນໄຫວຂອງ phytase ໃນແຕ່ລະຕົວຢ່າງການກະກຽມ (FTU ຕໍ່ 2 ມລ):

ກິດຈະ ກຳ (FTU / g) = (FTU ຕໍ່ 2 mL ×ການລະລາຍ) / ນ້ ຳ ໜັກ ຕົວຢ່າງ (g).


ການຄິດໄລ່, ຂັ້ນຕອນທີ 2 ຄິດໄລ່ການດູດຊືມສານທີ່ຖືກຕ້ອງ ສຳ ລັບ AR ສຳ ລັບການກະກຽມຕົວຢ່າງແຕ່ລະຕົວ (ການດູດຊຶມ Phytase Reference Solution minus ທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບການດູດຊືມ) ແລະ ສຳ ລັບແຕ່ລະໂປໂຊຊຽມ Dihydrogen Phosphate Solution, Ap (ການດູດຊຶມ Potassium Dihydrogen Phosphate Solution minus ໂດຍສະເລ່ຍການດູດຊືມບໍ່ໄດ້). ຄິດໄລ່ C, ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງຟອສເຟດຂອງໂຊລູຊຽມ Dihydrogen Phosphate ແຕ່ລະວິທີແກ້ໄຂ:

(W × 1000 × 2) / MW = C (mmol / 2 ມລ).

ຄິດໄລ່ການດູດຊືມສານ D ສຳ ລັບແຕ່ລະວິທີແກ້ໄຂໂພແທດຊຽມໂພແທດຊຽມໂພແທດຊ້ຽມຫຼັງຈາກການແກ້ໄຂ ສຳ ລັບປະລິມານໂພແທດຊຽມ dihydrogen ຊັ່ງນ້ ຳ ໜັກ:

Ap / C = D (ຫົວ ໜ່ວຍ ດູດຊຶມ / mmol ຂອງຟອສເຟດຕໍ່ 2 ມລ).

ຄິດໄລ່ສະເລ່ຍຂອງຜົນໄດ້ຮັບ D, ໃຫ້ E (ຄວາມແຕກຕ່າງທີ່ສາມາດອະນຸຍາດສູງສຸດ, 5%).
ຄິດໄລ່ກິດຈະ ກຳ ສຳ ລັບແຕ່ລະການກະກຽມການອ້າງອີງ Phytase:

(AR × f) / (30 × R × E) = FTU / g,

ໃນນັ້ນ AR ທຽບເທົ່າກັບການດູດຊຶມທີ່ຖືກຕ້ອງຂອງ Phytase Standard Solution; f ເທົ່າກັບປັດໄຈການລະລາຍທັງ ໝົດ ຂອງການກະກຽມກະສານອ້າງອີງ; 30 ເທົ່າກັບໄລຍະເວລາບ່ອນ, ໃນນາທີ; R ເທົ່າກັບນ້ ຳ ໜັກ ຕົວຢ່າງ, ໃນ g; E ເທົ່າກັບສະເລ່ຍຂອງປັດໃຈ D; W ເທົ່າກັບນ້ ຳ ໜັກ ຂອງໂພແທດຊຽມ dihydrogen, ໃນ g; ແລະ MW ເທົ່າກັບນ້ ຳ ໜັກ ໂມເລກຸນຂອງໂພແທດຊຽມ dihydrogen, 136.09 (g / mol).

ການຄົ້ນຄ້ວາພິສູດ

ການຫຸ້ມຫໍ່ແລະການເກັບຮັກສາ

ຖົງຫຸ້ມຫໍ່ອາຫານແຂງ, 25 ກິໂລ / ຖັງ.

Phytase ຄວນເກັບມ້ຽນໄວ້ໃນບ່ອນແຫ້ງ, ເຢັນແລະມີອາກາດຖ່າຍເທດີຈາກແສງແດດ, ຄວາມຮ້ອນ.

ການຈ່າຍເງິນ:T / T, Paypal, Western Union, ການຮັບປະກັນດ້ານການຄ້າຂອງ Alibaba, VISA, MasterCard, ການກວດສອບອີເລັກໂທຣນິກ, ການຈ່າຍເງິນຕໍ່ມາ, LC ແລະອື່ນໆ.